Processo de cultura de tecidos

A cultura de tecidos vegetais nada mais é do que o cultivo in vitro de qualquer parte de uma planta, seja esta uma simples célula, um tecido ou um órgão, sob condições assépticas (Biondi & Thorpe, 1981). Esta técnica está baseada no fato de que qualquer célula vegetal contém toda a informação necessária para regenerar uma planta completa através de processos de diferenciação (Cocking, 1986). Na Embrapa Clima Temperado, atividades nesta área são realizadas desde 1989 (Peters et al., 1989).
Segundo Matthews et al. (1986), a micropropagação permite obter um grande número de plantas, partindo-se de um único indivíduo, em relativamente pouco tempo e espaço. A limpeza clonal é uma técnica importante quando se quer obter plantas isentas de enfermidades, principalmente aquelas ocasionadas por viroses.
O cultivo in vitro consiste em retirar o tecido meristemático isolado ou acompanhado de um ou dois primórdios foliares, e mantê-lo em meio nutritivo apropriado até que se desenvolva uma gema e, em seguida, uma plântula (Quak, 1977; Frison e NG, 1981). O meio mineral básico para todas as etapas da cultura in vitro é o Murashige & Skoog (1962), acrescido de 100 mg/L-1 de mio-inositol e 30g/L-1 de sacarose, com pH ajustado para 5,8. O meio é distribuído em frascos, seguindo-se a esterilização em autoclave a 1,5 atm com 120°C por 20 minutos.
Os frascos contendo os tecidos em cultivo devem ser mantidos em sala de incubação à temperatura de 25 ºC durante o período claro, e 23°C no escuro, com regime fotoperiódico de 16 horas de luz (4000 lux ) durante 30 dias.
Após o enraizamento (Figura 1), as plântulas devem ser transplantadas para vasos contendo substrato comercial desinfectado, para que venha a se desenvolver normalmente (Figura 2). A taxa de sobrevivência das plântulas em casa de vegetação varia entre 85 e 95 %. O percentual de sucesso deve-se, principalmente, ao vigor durante o desenvolvimento inicial e à presença de um bom sistema radicular, sendo um processo diretamente relacionado ao ajustamento do meio de cultura e de reguladores de crescimento utilizados. Segundo Love et al. (1987), a presença de pelo menos uma raiz forte é essencial na transferência das plântulas para o solo, além de um bom desenvolvimento da parte aérea. A retirada das plântulas de um ambiente artificial se constitui em um fator de estresse, podendo ser atenuado com a utilização de técnicas como alta umidade, solução nutritiva, ambiente estéril, cuidados no manuseio e transplante. A cobertura dos vasos com plástico transparente e com sombrite durante duas semanas, para manter a umidade relativa alta e reduzir a luminosidade, proporciona crescimento vigoroso após o transplante.

Foto: Luis Antônio Suita de Castro Fig. 1 Frasco contendo plântulas de batata-doce em desenvolvimento, em nível de laboratório.

Foto: Luis Antônio Suita de Castro Fig. 2 Aclimatação das mudas de batata-doce em condições controladas de casa de vegetação.

Testes de Indexação de Viroses

O processo de cultura de tecidos isoladamente não pemite assegurar a ausência de organismos patogênicos nas plantas obtidas. Há necessidade que as plantas sejam avaliadas por meio da utilização de testes de indexação de viroses. Os principais testes utilizados são o desenvolvimento de sintomas característicos em plantas indicadoras ou o uso de testes sorológicos.
As principais plantas indicadoras de viroses de batata-doce são a Ipomoea nill (Figura 3A) e Ipomoea setosa (Figura 3B), que pertencem à mesma família botânica da batata-doce. São trepadeiras com folhas alternadas e que não possuem gavinhas, o próprio caule apresenta movimentos rotatórios que possibilitam seu enrolamento e fixação das hastes. Apresentam flores grandes e vistosas, com simetria radial.

Fotos: Luis Antônio Suita de Castro Fig. 3 Características da floração das plantas indicadoras de viroses de batata-doce, Ipomoea nill (A) e Ipomoea setosa (B).

As plantas indicadoras são multiplicadas por sementes, em vasos pequenos (capacidade de 750 gramas de solo úmido), contendo substrato. Entre o décimo e décimo quarto dia, atingem o desenvolvimento adequado, ou seja apresentam duas a três folhas verdadeiras. A enxertia inicia com a realização de um corte no sentido longitudinal da haste da planta indicadora, junto à axila de uma das folhas cotiledonares, tendo profundidade aproximada de 1,5 cm. A seguir é destacada uma folha da planta de batata-doce a ser avaliada. O pecíolo da folha é cortado, na forma de bizel, modelando-se ao formato do corte realizado na planta indicadora (Figura 4-A). O limbo foliar deve ser reduzido a 40%. A folha é encaixada no corte e processa-se o amarrio utilizando-se Parafilm ou plástico polietileno nº 8, para promover a soldadura dos tecidos vegetais. Terminada a enxertia, as plantas deverão receber cobertura com plástico transparente, para formação de câmara úmida, durante 4 ou 5 dias, evitando a desidratação do enxerto e favorecendo o pegamento. A cobertura com sombrite também é necessária durante este período, para redução da luminosidade (Figura 4-B). Após a retirada da cobertura plástica e do sombrite, as plantas devem ser tutoradas, evitando-se o entrelaçamento, bastante freqüente, devido ao hábito natural da espécie e rápido crescimento sob condições favoráveis de umidade e temperatura. O aparecimento de sintomas ocorre em torno de 10 dias após a enxertia, podendo-se avaliar as plantas até os 30 dias. Os sintomas geralmente se manifestam através do clareamento de nervuras, clareamento entre nervuras, manchas cloróticas, mosaicos , mosqueados, deformações foliares e nanismos. Freqüentemente esses sintomas apresentam-se associados, permitindo fácil identificação de plantas infectadas. Em alguns casos, a sintomatologia é típica do vírus que está presente na planta, como os sintomas causados pelo Sweet Potato Feathery Mottle Vírus (SPFMV), em Ipomoea setosa, onde é possível observar nítido clareamento de nervuras associado a deformações foliares (Figura 5).

Fotos: Luis Antônio Suita de Castro Fig. 4 Enxertia de um fragmento de folha de batata-doce na indicadora Ipomoea setosa (A) e aspecto das plantas indicado-ras enxertadas, durante o período de aclimatação em casa de vegetação (B).

Foto: Luis Antônio Suita de Castro Fig. 5 Sintomas de Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) em folhas da planta indicadora Ipomoea setosa.

Os testes sorológicos são mais rápidos e precisos, porém apresentam custo e execução elevado. Viroses como Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV), Sweet Potato Latent Virus (SPLV), Sweet Potato Mild Mottle Virus (SPMMV), Sweet Potato Caulimolike Virus (SPCLV) e Sweet Potato Chlorotic Fleck Virus (SPCFV) podem ser diagnosticados serologicamente com o uso do teste Dot.ELISA (Pozzer et al., 1994). O diagnóstico de algumas dessas viroses tem sido realizado em laboratórios da Embrapa (Figura 6).

Foto: Luis Antônio Suita de Castro Fig. 6 Teste sorológico utilizado para detecção de viroses. A cor amarela dos orifícios indica a presença do patógeno. Reações incolores indicam a sanidade da planta avaliada.